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硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒說明書

一、藥物概述及檢測原理

硝基咪唑類抗菌藥，主要用于治療和預(yù)防滴蟲、阿米巴原蟲及厭氧菌引起的感染。但由于本類藥物有致癌作用，很多國家禁止其用于畜、禽、水產(chǎn)等產(chǎn)品的養(yǎng)殖。我國規(guī)定禁止本類藥物作為動物的促生長劑。

本公司的硝基咪唑類酶聯(lián)免疫試劑盒使用zui新生物技術(shù)開發(fā)，具有方便、快速、靈敏等特點(diǎn)。

本試劑盒利用硝基咪唑類抗體與硝基咪唑類可產(chǎn)生特異性結(jié)合的性質(zhì)，先在酶標(biāo)板上預(yù)包被抗原，再加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和硝基咪唑類抗體，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的硝基咪唑類藥物與固定在酶標(biāo)板上的抗原競爭硝基咪唑類抗體，再加入酶標(biāo)記二抗反應(yīng)，后加入底物催化顯色。此時顯色深度與標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）中硝基咪唑類藥物的含量成反比。

二、試劑盒內(nèi)包含組分：

標(biāo)準(zhǔn)品工作液：0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb，1 mL/瓶。

96孔酶標(biāo)板：1塊

硝基咪唑類抗體工作液：1瓶（6mL/瓶）

酶標(biāo)Ⅱ抗工作液：1瓶（12 mL/瓶）

20×濃縮洗滌液：1瓶（30 mL/瓶）

組織樣品處理液Ⅰ：1瓶（干粉，選配，如有需求請向廠家索取)

牛奶樣本處理液：1瓶（10ml/瓶，選配，如有需求請向廠家索取）

復(fù)溶工作液：1瓶（50 mL/瓶）

底物A液：1瓶（6 mL/瓶）

底物B液：1瓶（6 mL/瓶）

終止液：1瓶（6mL）

說明書

蓋板膜

自封袋

三、用戶需要自備的設(shè)備和試劑

儀器：

酶標(biāo)儀（檢測波長450 nm、630 nm）

電子天平（精度：0.01 g）

離心機(jī)（3000 g及以上）

生化培養(yǎng)箱（可調(diào)4℃，25℃）

搖床

旋渦振蕩器

氮吹儀

微量移液器：（20μl-200μl、100μl-1000μl各一支、30-300ul八道排槍）

計時器

試劑：（試劑均為分析純）

乙酸乙酯

正己烷

氫氧化鈉

濃鹽酸

四、試劑盒特異性

試劑盒與其他硝基咪唑類藥物的交叉反應(yīng)率：

v 甲硝唑…………………………………100%

v 羥基甲硝唑……………………………47%

v 羥甲基甲硝咪唑………………………53%

v 替硝唑…………………………………2%

v 地美硝唑………………………………800%

v 奧硝唑…………………………………5%

五、樣本檢測步驟

1. 1工作液準(zhǔn)備

v 組織樣品處理液Ⅰ：將粉末藥品溶于200ml去離子水即得（如有需求請向廠家索取）。

v 組織樣品處理液Ⅱ：準(zhǔn)確量取400 mL乙酸乙酯和100 mL正己烷，充分混勻后待用。

v 洗滌工作液：取1份20×濃縮洗滌液加去離子水19份按照1:19的比例稀釋即得。

v 0.1M NaOH：稱取0.8 g NaOH，加入200 mL去離子水溶解。

v 1M HCL：量取1ml濃鹽酸，加入11mL去離子水溶解混勻。

2. 2樣品前處理

組織（雞肉、豬肉）（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 精確稱取2 g均質(zhì)后的組織樣品于50 mL塑料離心管中；

Ø 加入2 mL組織樣品處理液Ⅰ（見5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）以使處理液Ⅰ與樣本充分接觸；

Ø 加入8 mL組織樣品處理液Ⅱ（見5.1），充分震搖（或渦動）3 min（注：若實驗室配置有搖床，可充分震搖1min后使用搖床300rpm 25℃震搖10分鐘）；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 取4 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入2 mL正己烷，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min（或渦動30 s）；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上，離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

蜂蜜（稀釋倍數(shù)：0.5）

Ø 稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 加入2ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），強(qiáng)烈震搖使蜂蜜溶解；

Ø 加入4ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動1min）；

Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

原奶方法一（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出1ml樣本加入2ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入50μL 1M鹽酸（見5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

v 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油），再加入400μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。

原奶方法二（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 將采樣好的原奶樣本解凍后于室溫靜置平衡30min以上；

Ø 將槍頭伸入原奶樣本下層，小心取出2ml樣本加入50ml離心管中（注意：盡量不要取到上層的奶油）；

Ø 加入100μL 牛奶樣本處理液，再加入6ml乙酸乙酯，強(qiáng)烈震搖5min （或使用渦動儀渦動1min）；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 取1.5 mL上清液于潔凈的玻璃離心管中；

Ø 使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入1 mL正己烷，再加入0.5 mL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min（或渦動30 s）；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上，離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

生蛋方法一（稀釋倍數(shù)：1）

Ø 量取1ml全蛋樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取4ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，1ml正己烷，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動1min），離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

生蛋方法二（稀釋倍數(shù)：5）

Ø 取出1ml樣本加入2ml離心管中；

Ø 加入100μL 1M鹽酸（見5.1），強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 使用離心機(jī)室溫4000 g以上離心10 min；

Ø 取上層清亮液體100μL加入另一干凈離心管中，再加入400μL復(fù)溶工作液，強(qiáng)烈震搖1min （或使用渦動儀渦動30s）；

Ø 取50 μL液體進(jìn)行分析。

熟蛋（稀釋倍數(shù)：2）

Ø 稱取1g熟蛋樣本至50ml塑料離心管中；

Ø 依次加入1ml 0.1M 氫氧化鈉溶液（見5.1），8ml 乙酸乙酯,強(qiáng)烈震搖5min（或使用渦動儀渦動3min）使樣本與有機(jī)相充分接觸；

Ø 使用離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 移取2ml 上清液至10ml玻璃試管中(注意：不要取到下層水相)，使用氮吹儀于50-60℃水浴中吹干溶劑；

Ø 加入0.5 mL復(fù)溶工作液，1ml正己烷，強(qiáng)烈震搖2min（或渦動1min），離心機(jī)室溫3000 g以上離心5 min；

Ø 棄去上層正己烷及中間雜質(zhì)層（注：批量檢測樣本時使用本公司配套的GK-201型有機(jī)相吸除器可使操作更加安全、方便、快捷）；

Ø 取50 μL下層液體進(jìn)行分析。

3. 3檢測

準(zhǔn)備：將要使用的酶標(biāo)板條插入酶標(biāo)板架上，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，為減小檢測值波動建議做雙孔平行實驗（每個樣本/標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)兩孔），未使用的酶標(biāo)板條用自封袋密封后，保存于2-8℃環(huán)境中以防變質(zhì)；

加樣：向?qū)?yīng)微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液50 μL，再向每孔中加入50 μL抗體工作液；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于4℃避光反應(yīng)60 min；

洗滌：取出酶標(biāo)板后小心揭開蓋板膜，倒出板孔中液體后，在每孔加 250 μL洗滌工作液，浸泡15-30s后倒掉洗滌工作液，然后再加入洗滌工作液重復(fù)洗滌3~4次后，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，用力拍干；

加酶：在每孔中加入100 μL酶標(biāo)Ⅱ抗工作液（洗滌后的酶標(biāo)板在加酶前不宜在室溫環(huán)境過長時間放置，以防微孔干燥導(dǎo)致實驗結(jié)果差異）；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)20min；

洗滌：按照前面敘述的方法再次洗滌酶標(biāo)板；

顯色：在每孔中加入100 μL 底物A和底物B的混合液（注：底物A液、底物B液必須按體積1:1充分混合，混合液在10 min內(nèi)使用，切不可使用金屬容器盛裝、攪拌試劑以免底物變質(zhì)失效）；

孵育：輕輕振蕩酶標(biāo)板10 s，使孔內(nèi)液體充分混勻后，蓋好蓋板膜于25℃避光反應(yīng)15 min；

終止：在反應(yīng)后的微孔中加入終止液50μL/孔，底物液由藍(lán)變黃表明終止成功。

讀數(shù)：終止后的酶標(biāo)板應(yīng)在5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，建議使用450 nm、630 nm雙波長讀取酶標(biāo)板吸光度值。

4計算結(jié)果

設(shè)各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）的吸光度平均值為B，零標(biāo)準(zhǔn)（濃度為0 ppb的標(biāo)準(zhǔn)品）吸光度平均值B₀以(B/B₀)×100%為各標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）對應(yīng)的吸光度的百分比：

使用半對數(shù)系統(tǒng)代入標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的吸光度的百分比，與標(biāo)準(zhǔn)品濃度擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將待檢樣品吸光度的百分比代入擬合出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，即可得出樣品對應(yīng)的濃度，后乘以樣品相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中檢測物含量。

六、試劑盒參數(shù)

Ø 試劑盒靈敏度：0.1 ppb；

Ø 標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍：0.1 ppb-8.1 ppb；

Ø 板內(nèi)變異系數(shù)：<5%；

Ø 板間變異系數(shù)：<15%；

Ø B0吸光度ZUI佳值：>0.8；

Ø 回收率：90%±30%

Ø 樣品低檢測限：

豬肉、雞肉…………………………………………約0.5 ppb

蜂蜜…………………………………………………約0.1 ppb

原奶方法一…………………………………………約1 ppb

原奶方法二…………………………………………約0.2ppb

生蛋方法一…………………………………………約0.5 ppb

生蛋方法二…………………………………………約1.5 ppb

熟蛋……………………………………v……………約1 ppb

注：ppb=ng/mL或ng/g。

七、分析限制

本試劑盒為定量或半定量試劑盒，建議用于大量樣本篩查分析。若檢測結(jié)果為陽性，建議使用儀器方法開展確證實驗（如GC/MS、LC-MS/MS等）。

八、試劑盒貯存條件及有效期

Ø 試劑盒貯存在2-8℃有效期為一年，切勿凍存。

Ø 未使用完的酶標(biāo)板條須密封保存2-8℃的環(huán)境中。

九、注意事項

Ø 使用試劑盒前，請務(wù)必仔細(xì)閱讀說明書。

Ø 試劑盒使用前，需將盒內(nèi)各組份置于實驗臺上回溫至室溫（25±2℃）（提示：約1 h）。

Ø 試劑在使用前許搖勻，混合時應(yīng)避免出現(xiàn)氣泡。

Ø 槍頭為一次性用品，為防止試劑交叉污染，檢測過程中所用槍頭不得重復(fù)使用。

Ø 請勿使用過期試劑盒，不同批號試劑盒中的試劑不得混用。

Ø 樣品處理完畢后請立即分析，否則可能影響檢測結(jié)果。

Ø 底物A液、底物B液均為無色透明液體，若在使用前已變成藍(lán)色，或混合后立即變藍(lán)，說明試劑已污染或變質(zhì)。

Ø 加樣過程在保證精度的前提下一定要迅速，以免反應(yīng)時間差對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。

Ø 終止液中含有硫酸，若不小心濺上皮膚或衣物請立即用大量清水沖洗。若不慎ru眼，請在*清洗后去醫(yī)院檢查。

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